李政利;彭爱红;邹修平;何永睿;姚利晓;陈善春;

• 1:西南大学园艺园林学院
• 2:中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔工程技术研究中心国家柑桔品种改良中心

摘要(Abstract)：

[目的]建立柑橘转基因成分的多重PCR检测体系。[方法]根据GenBank中pBI121质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin基因序列,分别设计CaMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子特异引物和Actin基因的特异引物,建立能同时检测出4种序列的多重PCR检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及PCR反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR反应体系为:10×buffer 2.5μl,25 mmol/L MgCl22.0μl;dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0μl,10μmol/L的Actin基因、35S启动子、NOS启动子、NOS终止子引物分别加入1.0、1.0、1.5、0.5μl,模板DNA 0.1μg,Taq DNA聚合酶1.25U,加ddH2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃30 s,64.1℃45 s,72℃50 s,31个循环;72℃10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。

关键词(KeyWords)： 多重PCR;正交试验;检测;转基因成分

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 重庆市重点实验室专项(CSTC);; “863”科技部农村领域国家科技计划课题(2011AA100205);; 农业部/公益性行业(农业)科研专项(201003067);; 教育部科学技术研究重点项目(109131)

作者(Author): 李政利;彭爱红;邹修平;何永睿;姚利晓;陈善春;

Email:

DOI: 10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.16.120

参考文献(References)：

• [1]CLIVE J.2011年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J].中国生物工程杂志,2012,32(2):1-14.
• [2]HIDAKA T,OMURA M,UGAKI M,et al.Agrobacterium-mediated trans-formation and regeneration of Citrus spp.from suspension cells[J].Jpn JBreed,1990,40(2):199-207.
• [3]彭爱红,何永睿,许兰珍,等.柑桔转基因研究进展[J].热带作物学报,2011,32(7):1381-1387.
• [4]KLEPPIN L,SCHMIDT G,SCHRDER W.Cultivation of GMO in Germa-ny:support of monitoring and coexistence issues by WebGIS technology[J].Environmental Sciences Europe,2011,23:4.
• [5]TRAPMANN S,EMONS H.Reliable GMO analysis[J].Anal BioanalChem,2005,381:72-74.
• [6]EMONS H.GMO analysis-a complex and challenging undertaking[J].AnalBioanal Chem,2010,396:1949-1950.
• [7]邓汉超,尹长城,刘国振,等.转基因植物核酸成分检测技术研究进展[J].中国生物工程杂志,,2011,31(1):86-95.
• [8]CHAMBERCIAN J S,GIBBS R A,RANIER J E,et al.Detection screeningof the duchenne muscular dystrophy locus via mutiplex DNA amplication[J].Nucl Acids Res,1988,16:1141-1156.
• [9]CHAMBERLAIN J S,GIBBS R A,RANIER J E,et al.Deletion screeningof the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Res,1988,16(23):11141-11156.
• [10]GERMINI A,ZANETTI A,SALATI C,et al.Development of a seventargetmultiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean andmaize in feeds and foods[J].J Agric Food Chem,2004,52(11):3275-3280.
• [11]ONISHI M,MATSUOKA T,KODAMA T,et al.Development of a multi-plex polymerase chain reaction method method for simultaneous detectionof eight events of genetically modified maize[J].J Agric Food Chem,2005,53(25):9713-9721.
• [12]陈贞,芦春斌,杨梦婕,等.多重PCR检测转基因菜籽粕中的转基因成分[J].植物检疫,2011,25(3):35-38.
• [13]白月,才华,栾凤侠,等.多重PCR结合DHPLC方法检测番茄中转基因成分[J].作物杂志,2011(2):28-31.
• [14]范达,雷天刚,王军政,等.一种快速微量提取柑橘早期胚基因组DNA的方法[J].安徽农业科学,2011,39(9):5089-5090.
• [15]彭爱红,彭祝春,何永睿,等.根癌农杆菌介导甲型肝炎病毒(HAV)衣壳蛋白融合基因转化柑桔成年材料的研究[J].分子植物育种,2009,7(1):1-5.
• [16]郝玉芹,孙皆宜,李艾,等.正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究[J].安徽农业科学,2010,38(2):602-605.
• [17]JEYASEKARAN G,RAJ K,SHAKILA R,et al.Rapid detection of Salmo-nella enterica serovars by multiplex PCR[J].World J Microbiol Biotechn-ol,2011,27(4):953-959.
• [18]刘光明,苏文金,栾国彦,等.PCR方法检测食品中的转基因成分35S和NOS的研究[J].食品科学,2002,23(5):94-99.
• [19]BUSTAMANTE A V,SANSO A M,LUCCHESI P M,et al.Multiplex PCRassay for the detection of five putative virulence genes encoded in verotox-igenic escherichia coli Plasmids[J].Curr Microbiol,2011,62(5):1411-1415.
• [20]张明辉,高学军,于艳波,等.三重巢式PCR技术检测抗草甘膦转基因大豆深加工产品[J].农业生物技术学报,2006,14(5):752-756.
• [21]BRONZONIA R V M,MORELI M L,CRUZ A C R,et al.Multiplex nestedPCR for Brazilian alphavirus diagnosis[J].Transactions of the Royal So-ciety of Tropical Medicine and Hygiene,2004,98(8):456-461.