安徽农业科学

2014, v.42;No.436(03) 663-666

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人泛素结合酶UbcH5c活性突变体的构建·纯化以及催化活性研究
Construction,Purification and Its Activity Analysis of Human Ubiquitin-Conjugating Enzyme UbcH5c's Mutants

张西轩;李晔;阮海华;

摘要(Abstract):

[目的]构建人泛素结合酶UbcH5c的活性位点突变体S22R和F62A,同时分析这2种突变体蛋白与野生型蛋白在泛素化反应中的活性差异。[方法]通过点突变(Site-Directed Mutagenesis)的方法构建2种突变体质粒,利用0.5 mmol/L IPTG分别诱导2种突变体蛋白在大肠杆菌中进行表达;将菌体超声破碎后,依次利用阳离子交换层析法对UbcH5c突变蛋白进行分离纯化,最后利用体外泛素化酶促反应结合蛋白免疫印迹杂交的方法分析野生型UbcH5c与其活性突变体UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修饰上的差异。[结果]人泛素结合酶UbcH5c的2个突变体蛋白S22R、F62A的泛素化修饰程度明显弱于野生型蛋白。[结论]突变体S22R和F62A突变均不同程度的改变了人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子之间的结合活性,即2个突变的位点中第62位苯丙氨酸残基及第22位丝氨酸残基均是UbcH5c结合泛素的关键位点,而且后者对于UbcH5c结合泛素活性的影响更大。

关键词(KeyWords): UbcH5c;泛素化修饰;点突变

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然科学基金(81101220);; 天津市应用基础与前沿研究计划项目(12JCQNJC08100);; “十二五”天津市中青年骨干创新人才支持计划

作者(Author): 张西轩;李晔;阮海华;

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参考文献(References):

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